Výzkumníci vyvinuli a předvedli novou metodu pro vysoce výkonné třídění jednotlivých buněk, která využívá stimulovanou Ramanovu spektroskopii namísto tradičního přístupu k třídění buněk aktivovaným fluorescencí. Nový přístup by mohl nabídnout nedestruktivní způsob bez označení, jak třídit buňky pro různé aplikace, včetně mikrobiologie, detekce rakoviny a buněčné terapie.
Jing Zhang z Bostonské univerzity představí tento výzkum na Frontiers in Optics + Laser Science (FiO LS), který se bude konat 9. – 12. října 2023 v Greater Tacoma Convention Center v Tacomě (Metro Seattle), Washington.
“Náš přístup (stimulovaná Ramanem aktivovaná ejekce buněk, S-RACE) nabízí inovativní způsob třídění buněk na základě jejich intracelulárního chemického složení vysoce výkonným způsobem, ” vysvětluje Zhang. “Různé následné fenotypové a/nebo genomické analýzy by mohly být aplikovány na jednotlivé buněčné populace. Kromě toho je jejich kompatibilita s malými buňkami výhodná pro klasifikaci bakterií a jiných mikroorganismů. Například při použití S-RACE jsou patogeny nebo buňky, které vykazují specifické metabolické profily lze zachytit přímo z jejich přirozeného prostředí, např. vodních útvarů, půdy nebo gastrointestinálního traktu. Následné sekvenování umožňuje provádět úkoly, jako je identifikace buněčné taxonomie a posouzení ekologické funkce.”
Průtoková cytometrie se používá v mnoha biomedicínských oborech k rychlému počítání a charakterizaci mnoha typů buněk, včetně krevních buněk, kmenových buněk, rakovinných buněk a mikroorganismů. Klasifikace buněk na základě jejich velikosti, granularity nebo exprese buněčného povrchu a intracelulárních molekul může být použita k získání informací o biologických procesech nebo k oddělení buněk s určitými vlastnostmi pro další analýzu.
Ačkoli většina současných vysoce výkonných metod třídění buněk spoléhá na fluorescenční signály pro třídění, fluorescenční značky mohou narušit buněčnou funkci a nelze je použít s malými molekulami. Ramanova spektroskopie je slibnou alternativou, protože nabízí neznačené a nedestruktivní měření jednotlivých buněk získáním chemického otisku buňky. Bylo však obtížné dosáhnout silného Ramanova signálu a praktického mikrofluidního nastavení pro zobrazování buněk.
V nové práci vědci popisují, jak tuto výzvu překonali pomocí stimulované Ramanovy spektroskopie, která produkuje signál o několik řádů vyšší než běžně používaný spontánní Ramanův rozptyl. Pro klasifikaci jsou získány stimulované Ramanovy obrazy pro identifikaci objektů nebo buněk, které nás zajímají, a poté 2D galvo zrcadla namíří 532 nm pulzní laser na buňku. Nakonec je použit akusticko-optický modulátor jako rychlý selektor pulzů, takže jednotlivé laserové pulzy mohou být použity k zatlačení vybrané buňky do kolektoru. Každé vysunutí trvá jen asi 8 milisekund.
Vědci poprvé předvedli svou metodu vysunutí stimulovaných Ramanem aktivovaných buněk pomocí směsi 1-mikrometrových polymerních kuliček, čímž dosáhli asi 95% čistoty a 98% výtěžku s asi 14 ejekcemi provedenými každou sekundu. Ukázali také, že metodu lze použít u fixovaných bakterií.
Aby bylo možné použít metodu třídění na živé kvasinkové buňky, přidali vědci do ejekčního modulu tenkou vrstvu agaru, aby chránili buňky před teplem a vysycháním, a použili agarovou misku jako sběrač, který poskytuje více odpružení a vlhkosti během přistání. buňky. Výzkumníci použili systém k vypuzení přibližně 340 buněk kvasinek a pozorovali úspěšný buněčný růst v misce příjemce po asi 40 hodinách. Ukázali také, že do klasifikačního přístupu by mohly být integrovány další přístupy genomické analýzy, jako je kvantitativní polymerázová řetězová reakce.