Vědci vynalezli past k zachycení a porovnání jednotlivých bakteriálních buněk

Všechny nemocnice bojují s neviditelnou hrozbou: Pseudomonas aeruginosa. Je to druh bakterie, který ročně postihne tisíce pacientů na jednotkách intenzivní péče, kde může způsobit sepsi, zápal plic a další typy infekcí.

“Pro průměrného zdravého člověka nepředstavuje P. aeruginosa vážnou hrozbu,” řekl bakteriolog Joshua Shrout z University of Notre Dame. “Ale pro ty, kteří jsou nejzranitelnější – kteří jsou imunokompromitovaní, kteří používají ventilátor nebo katetr, nebo kteří se zotavují po popáleninách nebo velké operaci – to není jen vážné, ale i život ohrožující. A to kvůli sofistikované sadě bakterií.” taktika sebeobrany.”

Shrout, profesor na katedře civilního a environmentálního inženýrství a věd o Zemi, vede výzkumnou skupinu studující tyto taktiky do složitých detailů. Vysvětluje, že kromě odolnosti vůči mnoha nejběžnějším antibiotikům P. aeruginosa snadno přilne k povrchům, kde si vytvoří vlastní ochranu, a obalí se biofilmem podobným polymeru. Za určitých podmínek může P. aeruginosa také získat kmeny antibiotik z jiných organismů a může dokonce vytvářet kyanid, aby zabil konkurenty.

Myšlení mimo Petriho misku

Před deseti lety začal Shrout spolupracovat s Paulem Bohnem, profesorem chemického a biomolekulárního inženýrství Arthurem J. Schmittem a ředitelem Berthiaume Institute for Precision Health v Notre Dame. Bohnova laboratoř se specializuje na vytváření nových technologií pro přesnější analýzu buněk a molekul. Bohn a Shrout společně začali hledat nové způsoby, jak se dívat na mikroorganismy, jako je P. aeruginosa, a jít nad rámec tradičního procesu pohledu na buněčné kultury pěstované v Petriho misce.

“Pokud vyrostete a podíváte se na celou kulturu buněk, uvidíte průměrné obecné chování,” řekl Bohn. “Nyní ale víme, že největší dopady někdy pocházejí od menšiny dané populace.”

Shrout vysvětlil tento efekt pomocí analogie s chováním jiných organismů. “Představ si, že sedíš na zadní verandě a posloucháš venku cvrčky,” řekl. “Mohou existovat tisíce cvrčků, ale ti, kteří vás ovlivňují, jsou ti, kteří cvrlikají. V populacích bakterií by také mohly existovat podobné typy variací. Většina mikrobiologů však nemá nástroje k úplnému posouzení účinků malých hráčů. v rámci populace.”

Bohn a Shrout věděli, že než najdou velké rozdíly v populaci P. aeruginosa, budou muset vyřešit některé velké technické problémy. Nejprve by potřebovali zachytit jednotlivé buňky. Aby tedy provedli smysluplný experiment, museli by na buňky aplikovat stejný stimul stejným způsobem a ve stejnou dobu. A konečně by potřebovali způsob, jak experiment pozorovat, sledovat rozdíly mezi buňkami, jak reagují na podnět.

S financováním od Národního institutu pro alergie a infekční nemoci a National Science Foundation se Bohn a Shrout rozhodli prosadit nový přístup. “Nejprve,” říká Bohn, “nás uchvátila velmi jednoduchá otázka: ‘Co kdybychom vyvrtali díry o stejném průměru jako bakteriální buňky? Pokud to uděláme, mohli bychom přimět buňky, aby se pohybovaly a zůstaly uvnitř?” ”

Vybudování lepšího lapače bakterií

Allison Cutri, doktorandka chemie z Bohnovy výzkumné skupiny, přijala výzvu vytvořit zařízení jako součást svého disertačního výzkumu. Cutri spolupracovala s postdoktorandským výzkumným spolupracovníkem Vigneshem Sundaresanem na vývoji hlavní platformy zařízení v čistém prostoru zařízení Notre Dame Nanofabrication Facility. Použili aditivní proces, stavěli platformu vrstvu po vrstvě jako mikročip. Pro jádro zařízení použili vrstvu epoxidu a pokryli obě strany tenkou vrstvou zlata, aby vedla elektřinu k cílovým bodům na každé bakterii, jako by připojovali elektrodu ke každému konci článku.

Dále Cutri spolupracovala s integrovaným zobrazovacím zařízením Notre Dame na vytvoření více než 100 malých otvorů zvaných mikropóry v zařízení. Každý mikropór je perforován pomocí fokusovaného iontového paprsku na průměr menší než mikron – nebo asi 50krát menší než průměr lidského vlasu – aby se umožnilo bakteriím vklouznout dovnitř.

Díky sklonu P. aeruginosa přilnout k povrchům dokázala Cutri zachytit jednotlivé buňky v zařízení a do mikropórů, kde se každá usadila ve svém vlastním póru. Tým byl poté schopen aplikovat elektrické náboje přes vrstvy zlata při natáčení experimentu pomocí fluorescenčního mikroskopu speciálně navrženého pro pozorování třídy bakteriálních molekul.

Pozorovali záři studní, což prokázalo, že zařízení bylo řádně zatíženo bakteriemi. A jak testovali pluk po pluku buněk, všimli si, že se začaly objevovat vzory. Některé články zářily spolu s elektrickým nábojem. Jiné svítily přerušovaně v reakci na zatížení, zatímco třetí sada svítila bez ohledu na zatížení.

“Stále si nejsme jisti, jaké další rozdíly mohou existovat nebo co tyto rozdíly znamenají pro boj proti P. aeruginosa,” řekl Shrout. Při dalším zkoumání však byli schopni vidět podobné vzory u jiného typu bakterií: E. coli. Byli také schopni určit, že metabolický stav každé buňky – ať už absorbovala nebo vydávala energii – hrál klíčovou roli při utváření toho, jak se chovala.

Prozatím vědci uvedli, že doufají, že vzory, které pozorovali, a zařízení, které vytvořili a které byly nedávno popsány Cells Reports Physical Sciencesbude inspirovat podobné výzkumné projekty.

“Už nějakou dobu víme, že P. aeruginosa vykazuje fluorescenční chování v reakci na náboj,” vysvětluje Cutri. “Abyste si ale uvědomili, že existuje tolik variací ve způsobech, jak buňky reagují, potřebujete zařízení, které vám umožní podívat se na jednotlivé buňky. Se stávajícími přístupy by tyto rozdíly byly maskovány.”

Shrout dodal: “Jako výzkumník je obohacující nejen klást nové otázky, ale také vyvíjet nové nástroje a nové platformy, které tyto otázky umožňují. Spojením znalostí o chování buněk s nanofabrikací a zobrazováním ve vysokém rozlišení jsme byli schopni udělat s tímto projektem.”